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亞細(xì)胞成分的差速離心分離 ((/為沉降系數(shù)(/01&%0’232&4’ 54066&5&0’2),干式恒溫儀單位為秒。一般蛋白質(zhì)沉降系數(shù)的數(shù)量級(jí)為 !" !+ 7!" !* /, 人們以8901:0;<(8)單位來表示沉降系數(shù),即 !8=!" !+ /。沉降系數(shù)的大小與蛋白質(zhì)的密度與形狀相關(guān) (表 *,)。 表 ! "#幾種蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量與沉降系數(shù)的關(guān)系 蛋白質(zhì)分子相對分子質(zhì)量沉降系數(shù)(> 8) 核糖核酸酶 !* ,"" !? -$ 細(xì)胞色素 5 !$ @"" !? ," 肌紅蛋白 胃蛋白酶 !. *"" +. """ *? ") +? + !乳球蛋白 卵白蛋白 馬血紅蛋白 人血清白蛋白 血纖維蛋白原 )! $"" )) """ @-""" @, """ ++" """ +? !* +? $$ )? )! )? @ .? , 脲酶 豬甲狀腺球蛋白 )-" """ @+" """ !-? @ !,? * ( ( *?透析與超濾 ((利用具有半透膜性質(zhì)的透析袋將大分子的蛋白質(zhì)與小分子化合物分離的方法稱為透析( 1&3AB/&/)。 透析袋的截留極限一般
在相對分子質(zhì)量 $ """左右。將含有大相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的溶液裝入透析袋 內(nèi),再將透析袋置入水(或某種緩沖液)中,這樣,小相對分子質(zhì)量的物質(zhì)(無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑、小相對分子 質(zhì)量的抑制劑等)便可透過透析薄膜進(jìn)入水中,大相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)留在透析袋內(nèi)。透析過程中要 更換 +次 7$次袋外的透析液,以使透析袋內(nèi)的小分子物質(zhì)全部去除。有時(shí)將裝有高相對分子質(zhì)量蛋白 質(zhì)溶液的透析袋包埋入吸水劑(如聚乙二醇)內(nèi),袋內(nèi)的水與小分子物質(zhì)可被吸出透析袋,達(dá)到將袋內(nèi)蛋 白質(zhì)濃縮的目的。 ((超濾(CA2;36&A2;32&4’)是在一定的壓力下,使蛋白質(zhì)溶液在通過一定孔徑的超濾膜時(shí),小相對分子質(zhì)量 物質(zhì)濾過,而大相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)被截留,從而達(dá)到分離純化的目的。這種方法既可以純化蛋白質(zhì), 又可達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 ( ( +?凝膠過濾 ((凝膠過濾(<0A 6&A2;32&4’)又稱分子篩層析,在層析柱內(nèi)填充惰性的微孔膠粒(如交聯(lián)葡聚糖),將蛋白 第二章 #蛋#白#質(zhì)"! 質(zhì)溶液加入柱上部后,小分子物質(zhì)通過膠粒的微孔進(jìn)入膠粒,向下流動(dòng)的路徑加長,移動(dòng)緩慢;大分子物質(zhì) 不能或很難進(jìn)入膠粒內(nèi)部,通過膠粒間的空隙向下流動(dòng),其流動(dòng)的路徑短,移動(dòng)速率較快,從而達(dá)到按不同 相對分子質(zhì)量將溶液中各組分分開的目的(圖 ! !")。 圖 ! !"#凝膠過濾分離蛋白質(zhì) # #(三)根據(jù)蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)的分離方法 # #可以根據(jù)各種蛋白質(zhì)在一定的 $%環(huán)境下所帶電荷種類與數(shù)量不同的特點(diǎn),分離不同蛋白質(zhì)。常用 的方法有離子交換層析、電泳和等電聚焦。 # #&’離子交換層析 ##離子交換層析(()* +,-./*0+ -.1)2/3)01/$.4)應(yīng)用廣泛,是蛋白質(zhì)分離純化的重要手段之一。離子交 換層析的填充料是帶有正(負(fù))電荷的交聯(lián)葡聚糖、纖維素或樹脂等。根據(jù)層析柱內(nèi)填充物(交換劑)的電 荷性質(zhì)不同,離子交換層析可分為陰離子交換層析和陽離子交換層析。陰離子交換層析的交換劑本身帶 正電荷,而陽離子交換層析的交換劑帶負(fù)電荷。 ##以陰離子交換層析為例(圖 ! !5),將陰離子交換葡聚糖填入層析柱內(nèi),由于此種葡聚糖顆粒本身帶 有正電荷,吸附溶液中帶負(fù)電的蛋白質(zhì)陰離子。若用帶有不同濃度的陰離子(如 67)溶液進(jìn)行洗柱。洗 脫液中的陰離子取代蛋白質(zhì)分子與交換劑結(jié)合。低鹽濃度時(shí)帶電少的蛋白質(zhì)被優(yōu)先洗脫下來,隨著洗脫 溶液中陰離子濃度的不斷升高,帶電多的蛋白質(zhì)也不斷地被先后洗脫下來。若用不同
$%的緩沖液進(jìn)行 洗柱,隨著層析柱內(nèi)溶液 $%的變化,達(dá)到或接近其等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)由于不帶電荷而被洗脫下來。這樣, 利用離子交換層析,便將在洗脫過程中帶電程度不同的蛋白質(zhì)分離開來。 # #!’電泳 ##溶液中的帶電粒子在電場中的遷移稱為電泳(+7+-31)$.)1+8(8)。蛋白質(zhì)在低于或高于其等電點(diǎn)時(shí)分別 帶正電荷或負(fù)電荷,在電場中向陰極或陽極遷移。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小和所帶電荷的不同,可以通過電泳 將其進(jìn)行分離。根據(jù)支持物的不同,電泳有薄膜電泳、凝膠電泳等。薄膜電泳的支持物是濾紙或醋酸纖維 素薄膜等。 ##最常用的凝膠電泳有瓊脂糖電泳( /0/1)8+ +7+-31)$.)1+8(8)和聚丙烯酰胺凝膠電泳( $)74/-147/2(9+ 0+7 +7+-31)$.)1+8(8,:;<=)。這些支持物可以附于玻璃板上或玻璃柱中, :;<=還具有分子篩作用。人們常用 "!第一篇 #生物分子的結(jié)構(gòu)與功能 圖 ! !"#離子交換層析分離蛋白質(zhì) 十二烷基硫酸鈉( $%&’() &%&*+,-$(-./0*,121)將欲分離的蛋白質(zhì)分解為亞基,并由于 121是負(fù)電性很強(qiáng)的 物質(zhì),它可使所有的亞基均帶上大致相等的負(fù)電荷。這樣,在具有分子篩作用的 3456中,各種蛋白質(zhì)的 泳動(dòng)速率僅僅取決于其分子大小。這種電泳稱為 121 3456。如有已知相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作 對照,就可用于測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。電泳后,用蛋白質(zhì)顯色劑顯色,可以清楚地看到已分離的各條 蛋白質(zhì)區(qū)帶。 # #79等電聚焦 ##等電聚焦(’$%*-*+0:’+ .%+($’;<,=6>)與一般電泳的區(qū)別在于, =6>是在具有 ?@梯度的電場中進(jìn)行的電 泳,蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)不同予以分離。每種蛋白質(zhì)均有其特定的等電點(diǎn),在 ?@呈梯度的電場中,按其等 電點(diǎn)不同,帶有不同的電荷,于是向與其帶電相反的電極方向泳動(dòng)。這樣,在電泳時(shí)某一蛋白質(zhì)遷移到電 場中 ?@等于其等電點(diǎn)的位置時(shí),該蛋白質(zhì)便因不帶電荷而停止泳動(dòng)。這樣,各種蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)不同 圖 ! 78#蛋白質(zhì)的雙向電泳示意圖 第二章 !蛋!白!質(zhì)!! 得以分離。 ! !"#雙向電泳 !!雙向電泳($%& ’()*+,(&+-. *.*/$0&12&0*,(,,3 45)
是利用不同蛋白質(zhì)所帶電荷和質(zhì)量的差異,用兩 種方法、分兩步進(jìn)行的蛋白質(zhì)電泳。第一步是以聚丙烯酰胺凝膠為支持物,在玻璃管中進(jìn)行 657,使蛋白 質(zhì)按其不同的等電點(diǎn)進(jìn)行分離。第二步是將 657的膠條取出,橫放在另一平板上,進(jìn)行 848 9:;5。第 二次電泳的方向與 657垂直,使已按 657分離的蛋白質(zhì)再進(jìn)行一次按其不同質(zhì)量的再分離(圖 3 <=)。3 45的分辨率很高,可將大腸桿菌提取液分離出 > "==多個(gè)蛋白點(diǎn),每個(gè)點(diǎn)基本上代表一種蛋白質(zhì)。 45是研究蛋白質(zhì)組不可缺少的工具。 第五節(jié) !蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué) 一、蛋白質(zhì)組 !!蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ),生命活動(dòng)主要通過蛋白質(zhì)的功能來體現(xiàn)。遺傳信息的傳遞與表達(dá)都 需要蛋白質(zhì)的參與才能實(shí)現(xiàn)。隨著人類基因組計(jì)劃的完成,人類基因組精確圖的公布,生命科學(xué)已進(jìn)入了 后基因組時(shí)代,人們把目光轉(zhuǎn)向探索蛋白質(zhì)組(10&$*&)*)的工作。 !!蛋白質(zhì)組的概念是澳大利亞學(xué)者 ?# @# A(.B(+,和 C# D# A(..(-),于 >EE"年首先提出來的。蛋白質(zhì)組 是指一個(gè)組織或一個(gè)細(xì)胞中基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。更確切地說,蛋白質(zhì)組是指在特定條件下,一個(gè) 細(xì)胞內(nèi)所存在的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組比基因組復(fù)雜得多。人們推測,人類基因組雖然包含約 "= ===個(gè) 基因,卻可編碼 3F萬 G F=萬種蛋白質(zhì)。人的一種細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)總數(shù)約為 ># F萬種,且不同種的細(xì) 胞中所包含的蛋白質(zhì)又不完全相同。所以,已知一個(gè)基因組序列并不表明可以識(shí)別這個(gè)基因組所編碼的 全部蛋白質(zhì)和各種細(xì)胞內(nèi)實(shí)際的蛋白質(zhì)種類。即使基因組的序列可以用于預(yù)測其閱讀框,但還是不能準(zhǔn) 確地掌握其所表達(dá)的蛋白質(zhì)。這是因?yàn)榛蚪M中各基因的序列不能反映蛋白質(zhì)翻譯后的剪切與加工修 飾。翻譯生成的 )@H:經(jīng)不同的剪接,可以生成不同的蛋白質(zhì)序列。而且翻譯后的蛋白質(zhì)還存在修飾加 工過程。因此,只有知道細(xì)胞在不同發(fā)育時(shí)期、不同生理和病理狀態(tài)下全部蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,才有可 能最后反過來明了基因組中各基因的真正功能。 !!此外,同一生物個(gè)體不同體細(xì)胞中的基因組具有均一性,而蛋白質(zhì)組則不同,蛋白質(zhì)組具有時(shí)、空差 別。在個(gè)體的發(fā)育過程的不同階段,各種基因的表達(dá)與關(guān)閉各不相同,同一類細(xì)胞所包含的蛋白質(zhì)會(huì)有質(zhì) 和量的差異。同一個(gè)體的不同體細(xì)胞中蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量也各不相
同。組織細(xì)胞在分化過程中,正是 由于不同組織細(xì)胞中基因表達(dá)的質(zhì)和量的不同,各組織器官各有其特有的蛋白質(zhì),才出現(xiàn)千差萬別的組織 形態(tài)和功能表現(xiàn)。另外,即使是成年個(gè)體,由于組織細(xì)胞處于不同的生命活動(dòng)狀態(tài)(如運(yùn)動(dòng)、禁食、飽食等 物質(zhì)代謝的不同狀態(tài)),同一細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)成分和數(shù)量也有不同之處。此外,在病理?xiàng)l件下,病人發(fā)病、 治療與轉(zhuǎn)歸等過程中,細(xì)胞中蛋白質(zhì)組也會(huì)與正常生理狀態(tài)有所不同。 !!對于同一種蛋白質(zhì)來說,在不同的生理和病理?xiàng)l件下,即使其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變,也可能出現(xiàn)空間結(jié)構(gòu)的